同种反应性Th和CTL克隆的制备

 

同种反应性是指未免疫的鼠或人T细胞对同种异体细胞上组织相容性抗原的反应。尽管同种反应性T细胞克隆可从未免疫的脾细胞或淋巴细胞制备，但经同种抗原预刺激的细胞所获反应细胞的频率较高。细胞毒性和非细胞毒性T细胞可经有限稀释进行克隆。

 

材料与试剂

 

. 同种反应性鼠脾T细胞；

 

2. 以2000rad照射的同种鼠脾细胞作为刺激细胞。

 

3. 细胞培养所需的试剂和设备

 

4. 条件培养液（条件液）的制备

 

除了重组淋巴因子可用于T细胞克隆外，各种类型的条件培养液均可作为T细胞克隆的生长因子（T cell growth factors， TCGF）。不同的条件培养液含有不同的淋巴因子。ConA诱导的细胞培养上清含有大量的IL-2，但IL-4和IFN-γ的含量较低，而继发MLC培养上清含高水平IFN-γ，IL-2。PMA（TPA）激活的EL-4肿瘤细胞上清（EL-4上清）含IL-2。由此可根据不同的克隆选用不同的条件培养液。

 

① ConA诱导的细胞培养上清（ConA上清）：于24孔培养板孔中加入.25×06/ml鼠脾细胞和2.5μg ConA，置37℃5%CO2 温箱培养24～48h，离心收集上清，以CTLL-2或HT-2细胞检测其IL-2含量，分装，置-70℃保存备用。

 

② 继发MLC培养上清：取C57BL/6鼠脾细胞2.5×07 （反应细胞）与等量经过照射（2000rad）的DBA/2鼠脾细胞（刺激细胞）在20ml培养液中混合，置37℃，5%CO2温箱培养0～4d，作为原代MLC。离心收集原代MLC细胞，用培养液洗次。取6×06 原代细胞与2.5×07 经过照射的脾细胞混合，同上述条件培养36h，收集培养上清，置-70℃保存备用。细胞作为以下试验用的继发MLC细胞。

 

③ EL-4上清的制备：于24孔板加入06 /ml EL-4鼠淋巴瘤细胞和20ng PMA，培养4h。收集细胞，以培养液洗3次，加入培养液后继续培养36h。收集上清，置-70℃保存备用。

 

操作步骤

 

. 于96孔培养板孔中加入06 /00μl经过照射的同种脾细胞。

 

2. 取继发MLC细胞，用含ConA或MLC上清的培养液作有限稀释至～0个细胞/ml，于步骤（）板孔中加入50μl细胞悬液。培养4d后各孔加入50μl ConA或MLC上清和50μl培养液。继续培养7～0d。

 

3. 用5Cr释放试验测定细胞毒活性，以筛选同种反应CTL与Th。若细胞毒试验阴性，可以增殖试验测定Th活性。亦可通过IL-2、IL-4的产生或CD4、CD8的表达进行筛选。

 

4. 鉴定同种反应性T细胞的特征，如细胞毒活性、增殖反应或某些淋巴因子的分泌等。

 

5. 克隆细胞的维持:将2.5×04 ～×05 细胞转种24孔培养板孔中，同时加入×06 经过照射的同种脾细胞和含条件液的培养液，每周传代一次。