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东方体核酸检测试剂盒使用方法
发布时间:2022-11-15      点击次数:359

东方体核酸检测试剂盒说明书

技术原理:
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
       在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。( DNA高温变性低温复性)
       发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
东方体核酸检测试剂盒特点优势:
    .特异性:所有产品使用的引物均经过详尽的生物信息学分析,经过GenBank及自建庞大数据库的比对,确保所用的每一条引物均为种属或血清型特异的基因序列区段,可实现对细菌种属及血清型的特异检测,特异性均达到00。
    2.   重现性:该系列所有产品均经过大量实验菌株的验证,重现性为00。
    3.   灵敏性:该系列产品可实现对检测菌的高灵敏检测,当样品中细菌的浓度达到03cfu/ml时,可实现对其的直接检测,无需繁琐的增菌过程。
    4.   实用性:检测范围广,涵盖了对人体危害较为严重的7种呼吸道及肠道致病菌,可实现对临床样品及其他环境取样的快速检测,整个检测过程为3-4个小时。
    5.   优势:序列资源丰富,除GenBank公布的序列外,公司还进行了大量菌株的序列破译,从理论上保证所选引物具有良好的保守性和特异性。
    6.   优势2:该系列试剂盒均经过大量的保守性及特异性实验验证,凭借公司拥有的丰富的菌种资源,每一种检测试剂盒均经过了20余种标准菌株和临床菌株的保守性验证及40余种近缘标准菌株和临床菌株的特异性验证,确保在使用过程中不会出现任何的假阳性及假阴性报告结果。
需要自备的器材:
.方法仪器:分析天平、离心机、荧光 PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器(2 µL、20
µL、200 µL、000 µL)。
2.耗材:荧光 PCR 反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、.5 mL 经焦碳酸二乙酯(DEPC)水
处理的灭菌离心管、吸头(0 µL、200 µL、000 µL)、灭菌双蒸水。
东方体核酸检测试剂盒样本采集、存放及运输:
、样本采集:各类型样本按照常规方法采集;
2、存放:样本在2~8℃条件下保存应不超过72h,-70℃以下可保存,但应避免反复冻融(zui多冻融3次);
3、运输:采用泡沫箱加冰密封进行运输。
组成及试剂配制:
 
、酶标板:一块(96孔)
 
2、 标准品(冻干品): 2瓶,请临用前5分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml,盖好后室温静置大约0分钟,同时反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为200 U/L,然后做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释),分别配制成200 U/L,00 U/L,50 U/L,25 U/L,2.5 U/L,6.25 U/L,3.2 U/L,样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制00 U/L标准品:取0.3ml (不要少于0.3ml )200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
 
3、 样品稀释液:×20ml。
 
4、 检测稀释液A:×0ml。
 
5、 检测稀释液B:×0ml。   
反应五要素:
 
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
 
引物:引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则:
 
①引物长度: 5-30bp,常用为20bp左右。
 
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至0kb的片段。
 
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
 
⑤引物3'端的碱基,特别是末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
 
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列*有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
 
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
 
引物量:每条引物的浓度0.~umol或0~00pmol,以*引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。PCR实验步骤:
①产品仅用于科研取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其*溶解。
②两相分离 每ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lvfang,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体5秒后,5到30℃孵育2到3分钟。4℃下2000rpm离心5分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lvfang相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后5到30℃孵育0分钟后,于4℃下2000rpm 离心0分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液,每mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-0分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其*溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 )紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(:00)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
东方体核酸检测试剂盒PCR反应的特异性決定因素为
.引物与模板DNA特异正确的结合。
2.碱基配对原则。
3. Tag DNA聚合酶合成反应的忠实性。
4.靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及 Tag DNA聚合醇耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大増加加,被扩増的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式増加的,能将皮克(pg=0-29)量级的起始待測模板扩増到微克(ug=0-69)水平。能从00万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中zu小检出率为3个细菌。
(3)简便、快速
PCR反应用耐高温的 Tag DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩増液和水浴锅上进行变性退火-延伸反应,一般在2-4小时完成扩増反应。扩増产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
(4)对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总RNA均可作为扩増模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活PCR技术概论。
 
注意事项:   
 
、使用本试剂前请仔细阅读本说明书全文。
 
2 、操作时应尽量少说话,因口腔中也含有支原体,可能引起样品污染,而造成假阳性;整个检测过程中,反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行,以避免交叉污染。 
 
3 、实验时,试剂盒组分中的试剂使用前应充分融化并混匀(混匀时禁止激烈振荡,只需要进行上下倒置多次进行混匀)。
 
4、 反应管中加好所有的试剂后,应尽快上PCR仪进行扩增,以免形成过多的二聚体。
 
5、细胞培养物中含有和等抗不会影响本品的检测结果。如果用户需要进一步提高检测。
 

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