浅析进口ELISA试剂盒实验操作四大注意事项

　　一、ELISA操作前准备工作

　　进口ELISA试剂盒的选择

　　ELISA操作前，应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的进口ELISA试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。

　　样本处理

　　在收集标本前需有一个完整的计划，需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。

　　二、ELISA标准品溶解

　　标准品是进口ELISA试剂盒的检测抗原的一个度量标尺，因此标准品的溶解、倍比稀释和保存要特别注意以下细节：冻干标准品溶解按照说明书的要求，准确复溶。在冰上操作标准品为佳，静止5－0分钟，轻轻摇匀后按照一次量分装，在-20度或-70度保存。标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备，如离心管的准备和编号以及稀释液的准备；稀释时，应充分混匀；采用进口或者硅化的EP管，减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。

　　三、ELISA操作中的洗涤

　　洗涤是ELISA实验中是多次数的操作，也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象，实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管，还是洗板机，严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象，请比照“手工洗板小贴士”操作：

　　a)洗液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定会增高。

　　b)特别注意：设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开较好。同时注意甩掉洗液的动作翻转（从正上方旋转20－50度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体！甩出后以直线方式补2－3次甩出液体。

　　c)用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大。

　　d)每次拍板不要重复在一个地方拍，特别是洗去酶的步骤；拍板不宜过轻，否则拍不干净，拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重，以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下，后一次一定要扣干净。

　　e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短，洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。

　　四、ELISA的标准曲线如何拟合？

　　一般情况按照说明书方法拟合标准曲线。标准曲线可以由酶标仪附带软件自动生成，也可手动制作。标准曲线呈“S”形曲线，两端趋于水平，中间趋于线性，中间部分为较佳的检测范围。当标准品的量超过与包被抗体结合的量，此时标准品已饱和，再增加标准品的量，其OD值不再变化，故当标准品达到一定浓度后，曲线就趋于水平。一般厂商给出的浓度范围落在中间线性范围，根据标准曲线，可以测出样本的浓度。按照科学分析方法，如果存在“奇异点”或者“污点”，直接采用线性分析不是很好，要对拟合标准曲线的几个点进行取舍，同时也可改用双对数直线拟合或者四因素曲线拟合。