免疫共沉淀（Co-IP）试剂准备

免疫共沉淀（Co-IP）试剂准备

 1.  预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。

 2.  用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。

3.  加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5x106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶）。

 4.  用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。

 5.  4℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。

 6.  准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

 7.   每1 ml总蛋白中加入100 ul Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

 8.   4℃，14000 g离心1 5min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。

 9． （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。

 10.  用PBS将总蛋白稀释到约1 ug/ul，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 ug/ul）。

 11.  加入一定体积的兔抗到500 ul总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。

 12.  4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

 13.  加入100 ul Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 ul "过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。

 14.  14000 rpm瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。

 15.  用60 ul 2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 ul足够上三道）。

16.  将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min变性。