ELISA试剂盒方法类型和操作步骤

ELISA试剂盒方法类型和操作步骤

　　ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：① 固相的抗原或抗体，② 酶标记的抗原或抗体，③ 酶作用的底物，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的条件，可设计出各种不

　　同类型的检测方法。

　　(一)双抗体夹心法：

　　双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，操作步骤如下：

　　(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

　　(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与同相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

　　(3)加酶标抗体：使同相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

　　(4)加底物：酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可双抗原夹心法测定标本中的抗体。

　　(二)双位点一步法：

　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，

　　缩短了反应时间，如果使用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法测定中，应注意钩状效应(hook effect)，类同于沉淀反应中抗原过剩的后滞现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

　　(三)间接法测抗体 ：

　　间接法是检测抗体时zui常用的方法，其原理为利用酶标记的抗-抗体检测已与固相结合的受检抗体。故称为间接法。操作步骤如下：

　　(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

　　(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

　　(3)加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如： 欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人lgG抗体。

　　(4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。