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跨膜蛋白SEMA5A抗体抗体的生物素化标记实验要点

发布时间:2023-01-10      点击次数:19

跨膜蛋白SEMA5A抗体抗体的生物素化标记实验要点:


1. 如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在,会抑制标记反应。因此,蛋白质在反应前要对 0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L硼酸缓冲液充分透析;


2.所用的NHSB及待生物素化蛋白质之间的分子比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同,选择不当则影响标记的效率,应先用几个不同的分子比来筛选最适条件;


3.用NHSB量过量也是不利的,抗原的结合位点可能因此被封闭,导致抗体失活;


4.由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足,此时可加入去污剂如 Triton x-100, Tween20等;


5.当游离ε-氨基(赖氨酸残基的氨基)存在于抗体的抗原结合位点时,或位于酶的催化位点时,生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性;


6.生物素还可能与不同的功能基团,如羰基、氨基、巯基、异咪唑基及苯酚基,也可与糖基共价结合;


7.交联反应后,应充分透析,否则,残余的生物素会对生物素化抗体与亲和素的结合产生竞争作用;


8.在细胞的荧光标记实验中,中和亲和素的本底低,但由于链霉亲和素含有少量正电荷,故对某些细胞可导致高本底。

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