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鲑鱼补体蛋白3(C3)elisa试剂盒说明书
发布时间:2023-10-27      点击次数:249

鲑鱼补体蛋白3(C3)elisa试剂盒说明书

elisa试剂盒常见组成部分: 

1)酶和底物:在ELISA中zui常用的酶为HRP和ALP。

2)抗体:在ELISA中应用的抗体可分为多克隆抗体(多抗)和单克隆抗体(单抗)。

3)抗原:在ELISA中应用的抗原要求有较高的特异性、亲和力和纯度。主要有三类,即自然抗原、人工合成抗原和基因重组抗原。

4 包被:将免疫活性物质(抗原或抗体)结合于固相载体上的过程称为包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纤维薄膜等;常用的方法有吸附法、化学交联法及亲和素-生物素间接包被法

5)固相载体:固相载体是ELISA中用以分离结合标记物和游离标记物的主要手段,应与各种免疫活性物质有良好的结合性能并且不改变其免疫活性。常用的固相载体有聚苯乙烯塑料和硝酸纤维素膜。

样本实验前准备:

ELISA试剂盒液体样本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。

(1)血清

室温血液自然凝固10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

(2)血浆:

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

(3)尿液:

用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

(4)细胞培养上清:

检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。

(5)培养细胞

检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

(6)组织标本

切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。

操作步骤


1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在di一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在di一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从di一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为180 ng/L,120 ng/L ,60 ng/L,30 ng/,15 ng/L)。

2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4. 配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7. 温育:操作同3。

8. 洗涤:操作同5。

9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.

10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟。

注意事项


1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。


2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。


3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间好控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。


4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。


5. 底物请避光保存。


6. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.


7. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。


8. 本试剂不同批号组分不得混用。


9.如需代测或者样本暂时不测定,可立即低温冻存,温度越低越好,中间避免反复冻融,-20℃以下可保存三个月,-70℃以下可保存六个月。

10.试剂使用须知:

11.(1)请参照相关法规、文献、MSDS等信息,理解并掌握好试剂的特性,再进行安全操作。

12.(2)通常购买试剂时一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的话,更加注意其他保管和管理。

13.(3)万一试剂操作者并非专业技术人员。必须在专业人士的指导监督下进行操作。对于使用后的废弃物,不要或者旧的试剂,应按照相关法律法规正当处理。

14.(4)购买后,请务必确认标签上的注意事项;做好预防颠倒,摔坏的措施和管理体制;在使用前再次确认标签上的注意事项,做好必要的安全对策;对没有标明其危害特性、有害特性的,也要慎重地进行操作;必须带好防护用具,小心翼翼进行操作。


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