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免疫共沉淀(Co-IP)试剂准备

发布时间:2024-02-27      点击次数:37

免疫共沉淀(Co-IP)试剂准备

 1.  预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机。

 2.  用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS。

3.  加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶,0.5 ml/5x106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶)。

 4.  用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15 min(EP管插冰上,置水平摇床上)。

 5.  4℃,14000 g离心15 min,立即将上清转移到一个新的离心管中。

 6.  准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

 7.   每1 ml总蛋白中加入100 ul Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10 min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景。

 8.   4℃,14000 g离心1 5min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子。

 9. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)。

 10.  用PBS将总蛋白稀释到约1 ug/ul,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 ug/ul)。

 11.  加入一定体积的兔抗到500 ul总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。

 12.  4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

 13.  加入100 ul Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 ul "过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)。

 14.  14000 rpm瞬时离心5 s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800 ul/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS。

 15.  用60 ul 2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 ul足够上三道)。

16.  将上样样品煮5 min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5 min变性。

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