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牛棒杆菌探针法荧光定量 PCR 试剂盒

简要描述:牛棒杆菌探针法荧光定量 PCR 试剂盒注意事项:.基础程序;2.扩增温度和延伸温度;3.反应时间;4.循环次数;5.PCR 反应液的配制;6.PCR技术的基本原理;7.PCR的反应动力学;8.PCR扩增产物;9.PCR反应体系与反应条件。

  • 产品型号:GOY-M4152
  • 厂商性质:
  • 更新时间:2023-10-24 00:00:00
  • 访  问  量:296

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详细介绍

 【产品名称】牛棒杆菌探针法荧光定量 PCR 试剂盒

Name  :Corynebacterium Bovis Probe qPCR Kit
   【型号:GOY-M4152

【包装规格】50次/盒    
5.png                                                                

【预期用途】牛棒状杆菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)的某些细菌引起的膀胱炎和肾盂肾炎。临床主要特征为频尿、浊尿、血尿和发热。该病主要见于成年母牛,多在妊娠期和产后发病。本病分布于世界各地。因此快速灵敏检测牛棒杆菌具有重要意义。本产品就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据牛棒杆菌高度保守区设计,不会跟其他细菌的 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

【规格及成分】

成分

包装

2×Probe qPCR MagicMix

500 μL(本色盖)

荧光 PCR 专用模板稀释液

1 mL(黄盖)

牛棒杆菌探针法 qPCR 引物混 合液

100 μL(白盖)

牛棒杆菌 qPCR 探针

50 μL(棕色管)

牛棒杆菌探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL)

50 μL(黄盖)

使用手册

1

【运输及保存】低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月 

【自备试剂】样品 DNA。

【使用方法】一、稀释标准曲线样品

(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液,用带芯枪头,下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

牛棒杆菌探针法荧光定量 PCR 试剂盒二、样品 DNA 的制备 

7. 如果有 N 个样品,设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送 20次免DNA 提取的核酸释放剂,本产品的裂解液可以直接作为 PCR 模板,省略 了 DNA 提取步骤。

三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分/每管

 

样品管

N+2 个

RT-PCR

阴性对照

标准曲线样品管

1-6 管)

2×Probe qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

10 μL

牛棒杆菌 qPCR 探针

1 μL

1 μL

1 μL

牛棒杆菌探针法 qPCR 引物混合液

2 μL

2 μL

2 μL

N+2 个待测 DNA 模板

7 μL

-

-

超纯水

-

7 μL

-

7 步所得标准曲线样品稀释液(2-7 号)

-

-

7 μL(2 号样到2 号管,3 号样到 3 号管…)

 11.盖上盖子后上机,按面参数进行 RT-PCR:

过程

温度

时间

预变性

95℃

5 min

PCR 反应

40 个循环)

95℃

15sec

60℃

60sec(采集 FAM 通道的荧光信号)

 四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

 


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