总RNA提取实验

总RNA提取可以：（）获得高纯度、高质量的总RNA；（2）可以满足生物学下游实验NorthernBlot、核酸酶保护实验、RT-PCR、qRT-PCR 和阵列分析所需。
实验方法原理 总RNA 提取试剂盒，可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种的RNA酶抑制剂，异硫氰酸弧（GTC）和β-巯基乙醇，加上整个操作都在冰浴下进行，这样就能显著降低RNA 的降解速率。

GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
实验材料 微生物 动物细胞 植物组织
试剂、试剂盒 RNA 提取试剂盒 焦碳酸二乙酯 乙醇
仪器、耗材 恒温水浴 冷冻高速离心机 紫外分光光度计 取液器 电泳仪 电泳槽
 

实验步骤 一、细胞或组织破碎

. 微生物材料

（）发酵3-4天（或对数生）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。

（2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2-3次，并尽量除去残存的水。

（3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。

（4）研磨后的样品转移至2 ml变性液的容器中匀浆。

2. 动植物细胞培养材料 （适用的样品量为细胞：08）

（）细胞或组织培养：按常规方法进行。

（2）深层悬浮培养细胞的破碎。

①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3 000 g离心5分钟。

②细胞洗涤：上步沉淀用25毫升灭菌后冰冻的×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3 000 g离心5分钟。

③细胞破碎：在沉淀细胞中加入5 ml预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。

3. 表面培养细胞的破碎

（）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达08。

（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8 ml预冷变性液，转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。

（3）用无菌吸管将*个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推，直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从*个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。

（4）将上述2 ml含细胞的变性液转移至一50毫升无菌离心管中，匀浆破碎细胞。

3. 植物组织破碎 （适用的样品量为0.05 g组织）

（）将600 ul变性液置于.5 ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

（2）将0.05 g新鲜组织用液氮冰冻。

（3）在液氮下，研磨组织块。

（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。

4. 动物组织破碎 （适用的样品量为 g 组织）

（）将2 ml变性液置于50 ml离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。

（2）在上述管中加入 g新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。

二、RNA 的抽提

（） 在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul＋60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠*混匀，可用漩涡振荡器。

（2）600 ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\），*混匀或漩涡振荡器振荡0秒。

（3）冰裕中0-5分钟，离心，4℃，0 000 g，20分钟。

（4）上层水相吸至无菌离心管中+等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。

（5）离心4℃，0 000g，20分钟。

（6）沉淀RNA ，冷冻干燥5分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。

（7） 60 ul pH4.0的2M乙酸钠*混匀，可用漩涡振荡器。

（8） 600 ul酚\氯仿\异戊醇（25\24\），*混匀或漩涡振荡器振荡0秒。

（9） 冰裕中0-5分钟，离心，4℃，0 000 g，20分钟。

（0）上层水相吸至无菌离心管中。

（） 等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥，复溶于去RNA 酶的水中（对于准备保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。