植物RNAout

植物RNAout
产品及特点 本产品是天泽基因自主开发的*产品，其原理*不同于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取方法，克服了后者不能区分RNA （本质上是多糖）和其他植物多糖的缺点，能将RNA和其他植物多糖分开，同时还能有效去除多酚和其他植物次级代谢成份。其有效性在近五十多种各类植物（见附录，包括十分棘手的松柏类植物）中得到验证。
. 适用于绝大多数植物，从五十多种植物材料中都成功提取到了总RNA，其中包括松针、柏树、香蕉等用胍/酚/氯仿方法未能提取到RNA的植物（注：部分植物组织，如果实， RNase含量*, 需要另外加RVC抑制其活性）。
2. 操作简单快速，zui短可以只需要约十五分钟，可以全在室温下进行。
3. 得到的RNA平均 OD260/280在.9左右，可直接用于RT-PCR和Northern等研究。
规格及成分 成份 50 次包装 250 次包装
溶液A 50 mL 250 mL
溶液B 5 mL 75 mL
溶液C 25 mL 25 mL
溶液D 25 mL 25 mL
使用手册 份 份

运输及保存 常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂 氯仿、75%乙醇、RNA溶解液。
使用方法 . 准备
a） 估算试剂和组织细胞的用量并准备足够的氯仿、75%乙醇和RNA溶解液 （如RNASAVER、无RNase的水或有灭活残留RNase活性的液相RNase清除剂）。每次微量提取一般需要00-200 mg植物叶片、或50-00 mg植物种子、或200-500 mg植物果实。
b） 溶解溶液A沉淀。溶液A在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀*溶解。
2、 匀浆
a） 先将新鲜植物切成小块（保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块），放入0-5 mL塑料离心管中，加入 mL溶液A，然后用匀浆器匀浆5-20秒，将不超过 mL的匀浆液转移至干净的.5 mL塑料离心管中（可以不必转移非液体的细胞碎片）。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。有的植物组织（果实）含有大量水份，匀浆液会多于 mL，转移时也只取 mL。
b） 如果用砚磨法破碎植物组织，需将植物组织浸泡在 mL溶液A中再砚磨，尽量避免植物组织跟空气直接接触，然后将砚磨物转移到新的.5 mL离心管中。
3、 *次分相
a） 在装有裂解物的离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿，用手上下颠倒或振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
b） 室温2000-5000 g离心5分钟，两相间将有约5-0毫米厚的细胞破碎物。
c） 将上清液（约0.8 mL）转移到另一干净的.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。留下00 uL上清液不取。
4、 第二次分相
a） 在上清液中加入0.5 mL的溶液C和0.2 mL的自备氯仿，用手上下颠倒或振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。
b） 室温2000-5000 g离心3分钟，两相间将有白色膜状物（蛋白质）形成。
c） 将上清液（约 mL）转移到另一干净的.5 mL塑料离心管中,避免触及或吸取有机相及其上面的白色膜状物。
5、 沉淀
a） 在上清液中加入0.5倍体积的溶液D，用手上下颠倒或振荡器振荡30秒混匀，此时溶液呈白色浑浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。如果提取 50 mg以下的微量植物组织样品，在此步加入天泽基因的微量助沉剂RNADOWN。
b） 室温2000-5000 g离心3-5分钟，RNA将在管底形成白色沉淀（约黄豆大小）。如果组织样品量少或需要提高RNA回收率，也可以延长离心时间到20-30分钟。
c） 小心移弃上清液，避免触及管底RNA沉淀。
注意：如果加入溶液D离心后沉淀漂浮在上面，说明植物糖份多，溶液比重大，可以少加植物样品，也可以适当加无RNase的水稀释直到沉淀能够沉下去为止。如果离心后管底有类似氯仿的相出现，说明上一步离心时间不够或取上清时取到了下层的有机相，可以适当延长离心时间或取上清时留下约00 uL不取或在第四步时加0.3 mL的自备氯仿。
6、 *次清洗
a） 在离心管中加入mL 75%的乙醇，振荡器上振荡混均30秒。
b） 室温2000-5000 g离心分钟，RNA将在管底形成细小沉淀（约芝麻大小）。
c） 小心吸弃上清液,注意不要吸弃RNA沉淀。
7、 第二次清洗
a） 重复第六步一次。
b） 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液,注意不要吸弃沉淀。此步将有效去除残留的乙醇，否则后续反应会受到影响。
8、 溶解
a） 加入适量（一般为20-00 μL） RNA溶解液使RNA沉淀溶解，存放于-80℃或立即使用。千万不要用真空离心法使RNA沉淀过于干燥,否则RNA将变得十分难溶。
9、 检测
a） RNA完整性的电泳检测
如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：44，2000）。如果是简单检测，可以使用TAE或天泽基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9：558，990）。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以不要使用。
尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE所含硼酸是研究多糖的经典方法－－－－硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA污染）。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，是避免使用。
由于动物细胞中70-80%的RNA为rRNA，后者又由28S （约4800 nt），8S （约900 nt）和5.8S （约20 nt）三种组成，所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合EB的数量成正比（当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以28S rRNA条带的荧光强度一般比8S rRNA条带的荧光强度强.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。
跟动物一样，植物果实和种子的RNA一般有三条电泳带，但植物叶片的RNA有四条或更多rRNA带，多余的RNA来源于叶片中大量存在的叶绿体。
b） RNA产量产率测定
将5-0 μL RNA溶于TE缓冲液中（pH7.5-8.2之间）检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（ OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度X体积）和产率（RNA产量/组织用量）。
注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280，否则光吸收比在TE中测得的低0%-5%，因为核酸光吸收跟溶液pH相关，而DEPC水中的DEPC高压分解后产生的CO2 与水反应生成碳酸，使溶液pH降低进而降低RNA的光吸收。RNA的产率还随组织的营养状态和组织的种类不同而不同，00 mg种子的RNA产量一般为00-20 μg，00 mg叶片为30-60 μg, 00 mg果实为20-40 μg。
c） RNA纯度测定
无污染的总RNA的OD260/OD280一般在.8-2.之间（具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关），OD260/OD230一般在2.0-2.3之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分别用天泽基因的DNA Erasol 和PS Erasol去除。