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霉菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

简要描述：霉菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒注意事项：．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

产品型号：GY-L02109
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更新时间：2023-10-24 00:00:00
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PCR试剂盒能够快速识别细菌、病毒等微生物的存在

详细介绍

【产品名称】霉菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒

【型号：】GY-L02109

【包装规格】50次/盒

【产品及特点】霉菌是真菌的一种，其特点是菌丝体较发达，无较大的子实体。同其他真菌一样，也有细胞壁，寄生或腐生方式生存。霉菌有的使食品转变为有毒物质，有的可能在食品中产生毒素，即霉菌毒素。自从发现以来，霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。对人体健康造成的危害极大，主要表现为慢性中毒、致癌、致畸、致突变作用。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测霉菌通用的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物和探针经过优化，灵敏性高。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据霉菌通用DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7.本产品只能用于科研。

霉菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒【规格及成分】

成分	规格
A	500 μL
B	1 mL
C	1 mL
D	150 μL
E	50 μL
使用手册	1份

【运输及保存】低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

【自备试剂】 样品 DNA。

【使用方法】一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，用带芯枪头，下同。

3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.如果有N个样品待提取，设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数兼容。

三Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR

阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照	标准曲线样品管（1-6 管）
A	10 μL	10 μL	10 μL
D	3 μL	3μL	3 μL
N+2个待测DNA模板	7 μL	-	-
C	-	7 μL	-
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）	-	-	7 μL（1 号样到 1 号管，2 号样到 2 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	10 min
PCR反应（45个循环）	95℃	15 sec
PCR反应（45个循环）	60℃	60 sec（采集FAM通道的荧光信号）

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

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