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曲霉属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

简要描述:曲霉属通用探针法荧光定量PCR试剂盒注意事项:.基础程序;2.扩增温度和延伸温度;3.反应时间;4.循环次数;5.PCR 反应液的配制;6.PCR技术的基本原理;7.PCR的反应动力学;8.PCR扩增产物;9.PCR反应体系与反应条件。

  • 产品型号:GOYL44N
  • 厂商性质:
  • 更新时间:2023-02-24 00:00:00
  • 访  问  量:37

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详细介绍

 【产品名称】曲霉属通用探针法荧光定量PCR试剂盒

Aspergillus spp.   Aspergillus spp.Probe qPCR Kit

   【型号:GOYL44N

【包装规格】50次/盒    
5.png                                                                

【产品及特点】曲霉属,曲霉目中的一属,包括米曲霉、黑曲霉等。一方面有很多菌种可被用于各种有益物质的生产,如用于蛋白消化剂的蛋白酶(酱油曲霉)、柠檬酸(黑曲霉)、衣康酸(土曲霉、解乌头酸曲霉)以及曲酸(黄曲霉)等。但另一方面,也有不少侵害家禽、家畜甚至人体内脏特别是呼吸器官的病菌,如引起曲霉症的烟曲霉等。因此快速灵敏检测曲霉属具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测曲霉属通用的试剂盒,它具有下列特点:

1.即开即用,用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物和探针经过优化,灵敏性高。

3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4.特异性高,引物是根据曲霉属通用DNA高度保守区设计,不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5.既可用于定性检测,又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7本产品只能用于科研。

曲霉属通用探针法荧光定量PCR试剂盒【规格及成分】

成分

规格

A

500 μL

B

1 mL

C

1 mL

D

150 μL

E

50 μL

使用手册

1

【运输及保存】低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。

【自备试剂】  样品 DNA。

【使用方法】一、稀释标准曲线样品(以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1.标记6个离心管,分别为6,5,4,3,2,1。

2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液,用带芯枪头,下同。

3.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头,在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.如果有N个样品待提取,设置N+2个提取,多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水,使总体积与待提取样品的规定体积一致,以此作为PC。另外用水作为NC。

8.用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数兼容。

三Probe qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)

9.如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR

阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。


10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加):

成分

样品管

N+2 个

PCR

阴性对照

标准曲线样品管

(1-6 管)

A

10 μL

10 μL

10 μL

D

3 μL

3μL

3 μL

N+2个待测DNA模板

7 μL

-

-

C

-

7 μL

-

6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)

-

-

 

7 μL号样到 号管,号样到 号管


11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程

温度

时间

预变性

95℃

10 min

PCR反应

45个循环)

95℃

15 sec

60℃

60 sec(采集FAM通道的荧光信号

 四、数据处理 

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

 


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